宫颈癌筛查中HPV检测初筛的分流检测
文章编号:－()08－－04
宫颈癌筛查中HPV检测初筛的分流检测
韩钦综述，郭红燕审校
(医院，北京)
宫颈癌是常见的恶性肿瘤，只有进行有效的筛查才能做到早发现、早诊治，降低宫颈癌的发病率与死亡率。目前国内外宫颈癌筛查方案多样，但均有不同的局限性。随着高危型人乳头瘤病毒(HＲ-HPV)与宫颈癌及癌前病变关系的深入研究，HPV检测也成为宫颈癌筛查中重要的部分。HPV检测初筛对于宫颈癌及癌前病变的检出具有较高的敏感性，但特异性低。国内外研究者不断探索新式检测方法对HPV阳性者进行分流检测，以提高宫颈癌筛查的效力。目前国内外有关
HPV阳性者分流检测的方法包括细胞学检测分流、HPV分型检测分流、HPVmＲNA检测分流、分子标志物分流等。各种检测方法均有利弊，一些检测相关标志物的研究仍处于起步阶段，需大宗设计严谨的临床试验进行验证。
宫颈癌筛查;HPV检测;分流检测
中图分类号:Ｒ.33文献标志码:B
宫颈癌是常见的恶性肿瘤，据统计我国每年约有3万女性死于宫颈癌。只有进行有效的筛查才能做到早发现、早诊治，降低宫颈癌的发病率与死亡率。目前国内外宫颈癌筛查方案多样，但均有不同的局限性。细胞学检测是传统而经典的检方法，特异性高，但其敏感性相对较低，对阅片者水平要求高，在发展中国家的推广普及受到限制。年美国癌症学会(ACS)、美国阴道镜和宫颈病理学会(ASCCP)以及美国临床病理学会(ASCP)推出的联合指南推荐人乳头瘤病毒(HPV)检测与细胞学联合筛查方案，敏感性得到提高，但仍涉及细胞学相关问题，且费用较高。而随着对HPV病毒和其致病机制更进一步的研究，HPV分型检测逐步应用，其高敏感性、高阴性预测值的特点在筛查中具有一定意义，但特异性较低。国内外研究者不断探索新式检测方法对HPV阳性者进行分流检测，以提高宫颈癌筛查的效力。
1细胞学检测分流
多项研究证实，细胞学检测分流可以提高HPV检测初筛的特异性，阴道镜转诊率更低。Ｒijkaart等［1］对HPVDNA检测阳性者进行了14种分流检测的研究，发现细胞学检测分流方案的阴道镜转诊率最低，阴性预测值(NPV)为99.3%，Dijkstra等［2］的研究试验也得到了类似的结果。各项相关研究似乎都认为对高危型人乳头瘤病毒(HＲ-HPV)阳性者行细胞学检测分流具有较好的筛查效果，尤其是对HPV感染率低的人群。在32岁以上人群中，HPV初筛细胞学检测分流可适当延长筛查间期，具有较好的卫生经济学效益［3］。但目前已有的研究设计并不对细胞学阅片者设盲，也就是说阅片者已知某一患者的HPV检测结果，这是否会对最终结果产生影响目前还不确定，需要进一步设计更加完善的研究加以证实。
2HPV分型检测分流
研究已证实HPV16、18是与宫颈癌关系最密切的两种亚型，HPV16在50%～60%的宫颈癌中可以被检测到，在全球也有着较高的感染率。HPV16持续性感
染发生癌前病变的风险较其他高危型HPV更高。HPV18在10%～15%的宫颈癌中可以被检测到，尤其是腺癌或相关癌前病变。HPV分型检测可特异性分型HPV16和HPV18与另外12种高危HPV亚型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68)，被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于宫颈癌筛查检测。文献研究发现，对HPV阳性者行HPV分型检测分流与行细胞学检测分流对于CINⅢ的检出具有相当的敏感性，研究发现HPV初筛HPV分型检测或细胞学检
测分流具有较高的敏感性及特异性，控制阴道镜转诊率于可接受范围［4］。此外，HPV分型检测还可用于HＲ-HPV阳性细胞学检测阴性者的进一步分流，若其
HPV16/18为阳性，则在处理上应更加积极，如直接行阴道镜检测。至于HPV分型检测与细胞学检测作为分流检测孰优孰劣，尚需进一步的研究以评估。
3HPVmＲNA检测分流
HPVDNA检测技术主要检测HPVDNA是否存在，而对ＲNA的检测则着眼于病毒基因是否表达。HPVE6/E7是肿瘤相关基因，在HPV病毒DNA与宿主细胞DNA整合的过程中高表达，E6/E7的过表达高度提示癌变可能。E6/E7基因通过抑制肿瘤抑制蛋白P53及pＲb的活性，影响细胞周期调控。有研究认为E6/E7过表达高度提示HPV持续性感染乃至发生癌前病变的高风险，对于初筛检测分流具有一定意义［5］。多项研究发现HPVmＲNA检测对于检出CINⅡ以上病变(CINⅡ+)具有较高的特异性［6，7］。但目前尚缺乏对HPVmＲNA检测可重复性的评估，对其远期效果的研究及卫生经济学评价也仍为空白，还无法确定HPVmＲNA检测作为分流检测或初筛手段的意义。
4分子标志物分流
目前已有多种分子标记物被认为有助于宫颈癌或癌前病变的检测，如细胞周期调控、细胞增殖、DNA复制等相关蛋白。HPV病毒肿瘤相关蛋白E6/E7作用于宿主细胞可调控相关蛋白的表达，其他分子标志物作用于DNA表达或ＲNA表达。研究发现，这些分子标志物作为HPV阳性者的分流检测可增加检出CINⅡ+的特异性。
4.1HPV与宿主细胞整合相关蛋白标志物
4.1.1p16INK4
p16蛋白由p16基因表达，是细胞周期素依赖性激酶(CDK)抑制剂的典型代表，与多种肿瘤有关，对CDK4的活性有抑制作用，因而也称为p16INK4。p16过度表达提示正常细胞处于细胞周期的阻滞期，持续性HPV感染的细胞异常增生，导致p16过表达，因此p16过表达可作为宫颈病变的标志物。也有研究认为p16是HPV活动性感染的指标，是潜在高级别CIN敏感且特异的标志物，可作为宫颈癌筛查的检测方法之一。年7月，美国病理学家协会(CAP)和美国阴道镜和宫颈病理学会(ASCCP)指南指出，p16可作为反映HPVE6/E7影响细胞增殖的标志物，建议使用特定克隆号(E6H4)的p16INK4a抗体作为检测HPV感染是否影响到细胞周期调控的生物标志物。Ｒoelens等发表了荟萃分析比较p16INK4a与HPVDNA检测用于细胞学检测分流的效力，发现无明确诊断意义的鳞状上皮细胞病变(ASC-US)组中，p16INK4a在检出CINⅡ+病变的敏感性与HPVDNA相似，特异性更高;低度鳞状上皮细胞病变(LSIL)组中，p16INK4a敏感性稍低但特异性更高。Carozzi等［8］研究发现与细胞学检测相比，p16INK4a用于HＲ-HPV阳性女性分流检测的敏感性更高，但阴道镜转诊率相似。p16阳性表达并不仅局限于异常增殖的细胞，同样可见于输卵管化生、子宫内膜细胞以及宫颈正常的柱状上皮细胞，这些问题不会影响组织学染色及结果的判定，但对于宫颈癌筛查的细胞学样本影响很大。此外，免疫组化染色过浅也不利于结果的判定。虽然目前已有多种评分体系试图解决上述问题，但由于缺乏标准的判定方法，对细胞学样本进行p16染色应用于宫颈癌筛查的效力仍需验证。
4.1.2p16/ki-67
联合双染ki-67是一种标志着细胞周期进展及增殖期细胞的核抗原基因表达产物，为细胞增殖的一种标记，其表达仅限于细胞增殖周期的G1、S、G2期和M期，且在G0期表达缺失。ki-67过表达意味着细胞周期处于增殖期，细胞大量增殖。通常生理机能正常的细胞，p16和ki-67的表达会相互拮抗，不会同时出现。在同一细胞中同时检测到p16和ki-67则可作为细胞周期失调的标志物，提示pＲb蛋白失活，其与HＲ-HPV病毒诱导的致癌性转化相关，强烈提示高级别病变，能够帮助检出真正的病变细胞，且不依赖于形态学检查结果，可为区分潜在高级别病变妇女提供客观的检测指标。目前已有多项研究评估p16/ki-67联合双染在宫颈癌筛查的应用。Ikenberg等［9］研究发现在细胞学为ASC-US或LSIL组中，p16/ki-67联合双染较HＲ-HPV检测或p16单染对检出CINⅡ+有着更高的敏感性。欧洲大型多中心研究发现，p16/ki-67联合双染与细胞学检测相比，对检出CINⅡ+特异性相当，敏感性更高［10］。p16/ki-67联合双染也许可作为HPV检测筛查的分流检测。
4.1.3MCM2/TOP2A联合双染微小染色体维持蛋白2(MCM-2)和拓扑异构酶Ⅱ-α(TOP2A)是提示细胞周期S期异常的分子标记物，HPV肿瘤蛋白E6/E7
的表达与活化致使G1期向S期过渡受限。MCM基因是影响微染色体有丝分裂稳定性的主要基因，其编码的MCM蛋白是一组与DNA复制起始、延伸密切相关的蛋白质。当其发生异常时，可以引起细胞周期异常，进而引起肿瘤的发生发展。MCM-2是其家族成员之一，在许多肿瘤中显示出明显的预后意义。TOP2A
与DNA复制中的解旋过程有关。两种蛋白都高表达于受HPV感染细胞、高级别癌前病变及宫颈癌中。目前研究发现MCM2/TOP2A联合双染用于细胞学检测
分流对检出CINⅡ+有着较好的敏感性和特异性［11］。另一项研究则认为MCM2/TOP2A联合双染对细胞学ASC-US者分流较单独使用细胞学检测敏感性稍低［相对敏感性为0.96(0.95～0.97)］，但特异性更高［相对特异性为1.90(1.84～1.92)］。HＲ-HPV初筛MCM2/TOP2A联合双染分流的敏感性及特异性都高于单独使用细胞学检测［相对敏感性为1.30(1.20～1.41)，相对特异性为2.89(2.58～3.15)］［12］。但MCM2/TOP2A联合双染与p16类似，诊断受限于形态学，尚需建立系统的评分体系及标准的判定方法以解决。
4.1.4E6/E7蛋白HＲ-HPV的转化特性主要与两个早期开放阅读框架E6/E7基因相关，其在肿瘤发生，细胞周期调控，端粒酶活化及其凋亡调节中起重要作用。E6/E7肿瘤蛋白过表达与检测HPVDNA相比，对宫颈癌前病变及宫颈癌有着更好的预测价值。但由于提纯HPVE6/E7蛋白难度较高，相应抗体对检测E6/E7蛋白的敏感性尚不足以用于临床。近期一种针对多种HＲ-HPVE6/E7蛋白的单克隆抗体问世，研究发现其检出CINⅢ+的敏感性与HPVDNA检测相近，但特异性更高［13］。E6/E7蛋白用于宫颈癌筛查的意义尚需更多的研究加以证实。
4.2与HＲ-HPV感染有关的蛋白标志物
L1蛋白为HPV衣壳蛋白，在HPV与宿主细胞整合过程中，L1片段有可能为了逃避免疫而丢失，L1蛋白表达随病变级别升高而降低，在CINⅠ及CINⅡ中检出率约为80%，但高级别病变中则只有25%［14］。部分研究通过检测L1蛋白与p16蛋白发现与HPV感染有关的病变，L1阳性/p16阴性和L1阴性/p16阴性在CINⅠ/CINⅡ早期病变中阳性率为%及72%，L1阴性/p16阳性者则只有16%［15］。虽然L1蛋白低表达可能提示疾病进展，但部分高级别病变中L1蛋白仍可高表达，L1蛋白高表达并不能完全除外高级别病变的可能，限
制了其在临床中的应用。
4.3宿主基因甲基化标志物
在发生宫颈癌及其癌前病变过程中，宿主DNA和病毒DNA都发生改变。多项研究发现肿瘤抑制基因启动子CpG岛甲基化可抑制肿瘤抑制基因转录表达，与细胞周期、DNA修复、细胞间活化等过程有关。
4.3.1CADM1/MAL
CADM1/MAL基因为抑癌基因，涉及细胞内运输、基因表达、免疫调节，与肿瘤发生、发展有关。Viola等［16］回顾性对例HPV阳性者的细胞学剩余标本进行CADM1/MAL甲基化水平测定，CADM1/MAL甲基化阳性率随病变程度升高而增加，对于HPV阳性者的分流，CADM1/MAL甲基化与细胞学检测对于检出CINⅡ+及CINⅢ+的效力相当，二者联合能明显提高敏感性(对CINⅢ+敏感性为
88.7%，特异性为53.6%，阴道镜转诊率为53.6%)。
4.3.2POU4F3
POU4F3(POU结构域4翻译因子3)与ＲNA聚合酶Ⅱ核心启动子有关。一项研究对例HＲ-HPV阳性者的剩余细胞学标本进行检测，检测POU4F3、HS3ST2、AJAP1、PAX1和SOX15种基因的甲基化水平，研究发现POU4F3对于CINⅢ+检出的敏感性及特异性较高，为74%和89%，研究认为POU4F3也许可用于HPV阳性者的分流检测［17］。
4.3.3基因甲基化的联合应用
多项研究发现HPV宿主细胞的表生突变可作为宫颈癌前病变或宫颈癌的分子标志物。坏死相关蛋白激酶1(DAPK1)、CADM1和ＲAＲB基因甲基化水平与宫颈癌的发生有关，但单独应用某一基因甲基化水平作为标志物则敏感性较低，因此，相关研究多同时检测多种基因甲基化水平。研究发现，SOX1/PAX1、SOX1/LMX1A、SOX1/NKX6-1、PAX1/LMX1A、PAX1/NKX6-1、LMX1A/NKX6-1、JAM3/EPB41L3/TEＲT/C13OＲF18和CADM1/MAL等基因联合检测对检出CINⅢ+敏感性高达80%以上［18，19］，可能用于HPV检测的进一步分流。
4.4病毒基因甲基化
HPV基因甲基化水平受病毒生存状态影响，与宫颈病变也有关。HPV基因甲基化可能参与HPV基因与宿主细胞整合过程。研究发现，HPV16DNA的L1L2E2－E4PＲF的CpG甲基化水平与癌前病变的风险有关。HPV16DNA甲基化水平对于检测CINⅡ+有较好的敏感性和特异性，具有一定的预测意义。其他研究发现，CINⅢ患者HPV31DNA的部分E1及所有的L2L1甲基化水平较对照组明显升高，HPV18DNA除核苷酸片段L外的所有CpG甲基化水平都高于或等于对照组［20］。后续研究应对其他HＲ-HPV基因甲基化进行研究，并在不同年龄不同人群中对HPV基因甲基化的意义进行评估。甲基化标志物也许可用于基于人群筛查中HＲHPV检测的分流检测。但目前除CADM1/MAL，其他基因的效力尚未经过大宗临床研究证实。仍需更多的远期研究评估相关基因甲基化检测临床价值。在全球，宫颈癌筛查开展了近五十年，已大大减少了宫颈癌发病与死亡率，但宫颈癌筛查仍面临着费用高、人群覆盖率低及随访率低的三大“瓶颈”问题。
目前已有多项检测着眼于宫颈癌前病变发生的各个相关环节，希望能通过检测相关标志物筛选出HPV阳性者中真正发生癌前病变的患者，但这些检测的相关研究仍处于起步阶段，其分流效力仍需大宗设计严谨的临床试验进行验证。
参考文献
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